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本制品可用于纯化大多数的免疫球蛋白，与所有的人源IgG的亚类结合，并且与IgA，IgE，IgM和IgD也有一定的结合能力。因此Protein A/G Plus Beadose纯化树脂具有比单个Protein A/G更宽的种类结合范围。与非重组Protein G不同，Protein A/G混合柱料纯化树脂不结合血清白蛋白，因为去除了编码白蛋白结合位点的基因序列。Protein A/G混合柱料纯化树脂是从IgG亚类中纯化和检测小鼠单克隆抗体的工具，因为它能结合所有小鼠的IgG亚类，但不结合IgA，IgM或鼠脑白蛋白。

• 更高的抗体结合能力；
  
• 较低的非特异性吸附；
  
• 洗脱条件更均一，纯化抗体纯度更高;
  
• IP与Co-IP常用填料。

• 缓冲液准备：
  
  • 结合/洗涤缓冲液(Binding/Wash Buffer)：0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0～7.5。
    
  • 洗脱缓冲液(Elution Buffer)：0.1M柠檬酸，pH3.0或0.1M甘氨酸，pH3.0。
    
  • 中和液(Neutralizing Buffer)：1M Tris-HCL，pH8.5。
  也可选购百奥莱博产品：结合/清洗缓冲液(Binding/Wash Buffer)(货号：GS4764)、洗脱缓冲液(Elution Buffer)(货号：GS4763)和Tris-HCl溶液(1M,pH8.5，无菌)(货号：GS2013)
  该纯化过程针对0.5mL柱体积进行了优化，试剂的体积可以根据柱的大小进行放大或缩小。
  注意：所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
  
• 纯化步骤：
  
  • 样品制备：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液1:1对血清样品、腹水或细胞培养液稀释或将样品加入到结合/洗涤缓冲液中透析过夜；
    
  • 层析柱和树脂制备：轻轻倒转瓶子混合浆料以完全悬浮树脂。预先加入1mL结合/洗涤缓冲液到层析柱中，使用移液管将1mL的Protein A/G混合树脂转移到柱中，静置待树脂沉淀后将缓冲液从柱孔排出，然后再加入5倍柱体积的结合/洗涤缓冲液进行平衡；
    
  • 样品纯化：待树脂中平衡液流净后，缓慢将待纯化样品加入到树脂中，收集流出液。
    
  • 用10～15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗脱非特异性吸附的抗体，收集洗杂液。
    
  • 再用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集流出液，即目的蛋白组分。
    
  • 洗脱后的目的蛋白组分需要立即调成中性，以免低pH值是纯化后的蛋白变性失活，一般建议使用洗脱组分体积的1/10的中和液进行中和；
    
  • 在位清洗：依次使用3倍柱体积的结合/洗涤缓冲液，5倍柱体积的去离子水，5倍柱体积的20%乙醇洗涤树脂。树脂加入相同体积的20%乙醇，保存在2～8℃，不可冻存；
    
  • 柱的再生：Protein A/G纯化树脂可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降并严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。
    去除一些沉淀或变性物质
    用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。
    去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
    用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。

• 在进行IP实验前需确认蛋白表达情况并用抗体做探针识别诱饵蛋白和目的蛋白，如果诱饵蛋白通过WB没有检测到，那无需进行免疫沉淀实验，必须确认诱饵蛋白是否已经表达；
  
• 每份裂解液建议含有的大致相同数目的蛋白，此步可通过多次转染及尽可能修正使用的DNA数目、蛋白表达时间或细胞株来解决；
  
• 建议选择易于培养且有高转染效率的细胞。

• 取100μL的Protein A/G混合树脂(50μL树脂体积+50μL的填料保护液)，加入2倍体积的1×PBS洗涤Protein A/G混合树脂两次，再向Protein A/G混合树脂中加入1倍体积的1×PBS缓冲溶液混合。建议在洗涤Protein A/G混合树脂时切开移液器吸头，以免珠粒被刺破；
  
• 每100μL的Protein A/G混合柱料纯化树脂(50μL树脂体积＋50μL的1×PBS)中加入1mL细胞裂解液，4℃下在摇床或轨道振荡器上孵育10min，在后续的测试中裂解液能够减少蛋白质与树脂的非特异性结合；
  
• 4℃下以12000g离心10min去除Protein A/G混合柱料纯化树脂，将上清液转移到干净的离心管中；
  
  • 步骤1～3为裂解液预清理，因部分内源物的低活性及蛋白印迹对目的蛋白检测的特异性，在一般情况下，预清理是可以省略的，但在第一次进行特异的免疫沉淀时，不建议省略此步。
• 确定细胞裂解物中蛋白质浓度(若用Bradford法测定浓度，测试前至少1∶10稀释细胞溶解物，因为裂解缓冲液中的洗涤剂对考马斯亮蓝会有干扰作用，请先确认好裂解液中相关组分对蛋白定量方法的影响)；
  
• 用1×PBS稀释细胞裂解物至约1μg/μL细胞蛋白的含量，以减少缓冲液中洗涤剂的浓度。而对于倾向于低浓度表达的免疫沉淀蛋白，可使用浓缩的细胞液(10μg/μL)；
  
• 每500μL细胞裂解液中加入相应稀释倍数后的捕获抗体(1μg/μL或10μg/μL)。定量免疫沉淀目标蛋白的最佳量必须对每个样本进行实证检验；
  
• 在摇床或轨道振荡器上，将细胞裂解物与抗体混合后的产物4℃下轻轻摇动2h或过夜；
  建议：在激酶和磷酸酶测定中免疫活化酶的孵育时间为2h。
  
• 再取100μL的已用1×PBS洗涤过的Protein A/G纯化树脂(50μL树脂体积+ 50μL的1×PBS)加入到细胞裂解物/抗体混合物中，4℃下在摇床或轨道振荡器上轻轻晃动1h或过夜来捕获免疫复合物(以保证填料始终处于混悬状态)；
  
• 4℃下以12000g离心收集树脂，此时树脂上已带有捕获抗体和相关的蛋白复合体，用移液枪小心吸取上清液并预留10～20μL上清液作为树脂保护液，多余上清液弃掉，用800μL预冷RIPA裂解液或1×PBS缓冲液洗涤球珠3次，清洗请通过轻弹或颠倒试管温和重选树脂填料，整个过程保持低温环境；
  
  • 变性洗脱：向树脂中加入60μL的2×Loading Buffer，轻轻混匀。能够允许足够的容量来运行三个泳道。将树脂煮沸5min，使得免疫复合物与球珠分离，室温下14000g离心除去珠粒，转移上清液20μL进行SDS-PAGE分析；
    注意：若样品冻融后再使用时必须再次进行煮沸后再进行SDS-PAGE电泳。
    
  • 非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析，向离心管中加入5倍洗脱Buffer，用移液枪吹打5次，混匀后在室温下轻轻翻转离心管，10min后离心，800g离心1min，吸取上清为洗脱组分，即为目标蛋白，洗脱后的目的蛋白组分需要立即调成中性，以免低pH值是纯化后的蛋白变性失活，一般建议使用洗脱组分体积的1/10的中和液进行中和用于后期的功能分析。